今日喆圖小編教大家如何提取質粒DNA的實驗,相關設備:恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、真空干燥箱
實驗方法原理
堿裂解法是基于DNA的變性與復性差異而達到分離目的的。堿性使質粒DNA變性,再將pH值調至中性使其復性,復性的為質粒DNA,而染色體DNA不會復性,纏結成網狀物質,通過離心除去。
實驗材料
大腸桿菌
試劑、試劑盒 Tris-HclEDTA葡萄糖NaOHKAacNaAc異丙醇溶菌酶酚:Cl仿無水乙醇LB培養(yǎng)基
儀器、耗材 超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、搖床、恒溫水浴鍋、臺式離心機取液器、低溫冰箱冷凍、真空干燥機、電泳儀水平電泳槽、紫外觀測儀
實驗步驟 一、材料與試劑準備
1. 材料:大腸桿菌。
2. 儀器:超凈工作臺,恒溫培養(yǎng)箱,搖床,恒溫水浴鍋,臺式離心機,取液器一套,低溫冰箱,冷凍真空干燥機,電泳儀,水平電泳槽,紫外觀測儀。
3. 試劑:(1)Solution I :25 mM Tris-Hcl(pH7.4),10 mM EDTA(pH8.0),50 mM葡萄糖,高壓滅菌,4℃保存。(2)Solution II :0.2 M NaOH, 1%SDS 現配現用。(3)Solution III :5 N KAc pH4.8,高壓滅菌,4℃保存。(4)3 M NaAc pH5.2,高壓滅菌,
4℃保存。(5)異丙醇,溶菌酶(8 mg/ml),酚/Cl仿,無水乙醇,70%乙醇,LB培養(yǎng)基,電泳試劑。
二、操作步驟
1. 細菌繁殖:LB培養(yǎng)基,2 ml/20 ml,37℃,200 rpm,搖一搖,過夜。
2. 離心10 min,5 000 rpm, 4℃;棄上淸液。
3. 沉淀(菌體細胞)預冷的TES緩沖液洗滌,離心10 min,5 000 rpm, 4℃,加入預冷的1 ml Solution I,冰浴10 min。
4. 重新懸浮,加入150 ul溶菌酶母液,室溫放置5 min。
5. 加入1.2 ml Solution II, 冰浴5 min。
6. 加入0.9 ml預冷乙酸鉀,混勻,離心10 min,12 000 rpm,4℃。
7. 加入1.5 ml異丙醇,-20℃冰箱內放置15 min。
8. 離心10 min,12 000 rpm,4℃。
9. 取沉淀,懸于400 ul TE緩沖液中。
10. 加入40 ul,3 M NaAc。
11. 酚/Cl仿,抽提,乙醇沉淀。
12. 離心10 min,12 000 rpm,4℃。
13. 取沉淀,冷凍干燥,再懸浮于50 ul TE緩沖液中。
14. 電泳檢測提取DNA的質量。
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