在傳統(tǒng)的軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)中,細(xì)胞生長在上層含有細(xì)胞培養(yǎng)基的軟瓊脂中,下層軟瓊脂也與細(xì)胞培養(yǎng)基混合,但含有較高濃度的瓊脂。這可以防止細(xì)胞貼附在培養(yǎng)板上,還可以使轉(zhuǎn)化細(xì)胞形成可見的菌落。這種技術(shù)的原理是正常細(xì)胞依靠細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的接觸才能生長和分裂,相反,不管周圍環(huán)境如何,轉(zhuǎn)化細(xì)胞均具有生長和分化的能力,因此能夠以錨定獨(dú)立的方式形成菌落的細(xì)胞被認(rèn)為是轉(zhuǎn)化和致癌的。下面喆圖小編介紹一種用水浴鍋做相關(guān)實(shí)驗(yàn)的方法,這種方法的總體目標(biāo)是以半定量和嚴(yán)格的方式測定細(xì)胞的這種能力。
實(shí)驗(yàn)操作:
準(zhǔn)備材料和試劑:
1、配制2×培養(yǎng)基:1 g培養(yǎng)基粉末,0.2 g碳酸氫鈉,加入去離子水,定容到50 mL。
2、將培養(yǎng)基經(jīng)0.2 μm濾膜過濾除菌。
3、加入目標(biāo)細(xì)胞所需培養(yǎng)基的其他成分。例如:用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)CMT 167細(xì)胞需要加入10% FBS,1% 青霉素/鏈霉素。使用之前將培養(yǎng)基放在37°C水浴鍋。
4、配制1×培養(yǎng)基,依照目標(biāo)細(xì)胞生長所需培養(yǎng)基配制。
5、配制1%瓊脂:1 g瓊脂加入到100 mL去離子水中。
6、配制0.6%瓊脂:0.6 g瓊脂加入到100 mL去離子水中。
7、將配好的瓊脂經(jīng)高溫高壓滅菌,滅菌后可放在4°C保存,使用前加熱至*溶解。
8、配制氯化硝基四氮唑藍(lán)試劑:1 mg/mL氯化硝基四氮唑藍(lán)加入到1×PBS中。
鋪下膠:
1、將熔化的1%瓊脂溶液和預(yù)熱的2×培養(yǎng)基放入裝滿熱水(42°C)的桶(或水浴鍋)中,在熱水里放一個(gè)50 mL的錐形管。將桶放入超凈臺內(nèi)。
2、6孔板中的每個(gè)孔需要加入1.5 mL混合的瓊脂和培養(yǎng)基,為保證足夠的量,一個(gè)6孔板準(zhǔn)備12 mL。
3、首先加入6 mL的培養(yǎng)液到50 mL的錐形管,再加入6 mL的1%瓊脂溶液。將錐形管多次翻轉(zhuǎn)混勻,每個(gè)孔中迅速加入1.5 mL混合液,加混合液時(shí)不能產(chǎn)生氣泡。
4、室溫靜置30 min,待下膠凝固。
鋪上膠:
1、收獲的細(xì)胞用胰蛋白酶消化,用培養(yǎng)基以1:5的比例稀釋(如1 mL胰蛋白酶,加4 mL培養(yǎng)基),放入15 mL錐形管。
2、細(xì)胞計(jì)數(shù):以每孔5000個(gè)細(xì)胞作為起始,并根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整。
3、細(xì)胞懸浮液的體積需要1.5 mL。一個(gè)6孔板準(zhǔn)備12 mL細(xì)胞懸液。
4、將熔化的0.6%瓊脂溶液放入裝有熱水(42°C)的桶中,在熱水里放一個(gè)50 mL的錐形管。將桶放入超凈臺內(nèi)。
5、以1:1的比例混合0.6%瓊脂溶液和細(xì)胞懸液,吸取6 mL細(xì)胞懸浮液到50 mL錐形管,再加入6 mL的0.6%瓊脂溶液?;靹蚝笱杆偌尤?孔板中,每孔1.5 ml。小心避免產(chǎn)生氣泡。
6、室溫靜置30 min,待上膠凝固后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱。
7、足夠的菌落形成所需的時(shí)間因每個(gè)細(xì)胞系而異,通常為21天左右。每星期加兩次100 g的培養(yǎng)基以防止干燥。
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