轉(zhuǎn)染是真核細(xì)胞主動或被動導(dǎo)入外源DNA片段而獲得新的表型的過程。電擊完成后用恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行測試也是很關(guān)鍵的步驟,下面給大家介紹下電轉(zhuǎn)染詳細(xì)步驟。
1.清洗電轉(zhuǎn)杯,將電轉(zhuǎn)杯置于75%酒精中浸泡2小時,然后在紫外燈下照射后即可使用。
2.電穿孔前一天,以合適密度傳代細(xì)胞,使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前出于對數(shù)生長期。對于原代培養(yǎng)細(xì)胞,一般培養(yǎng)2-3天后,細(xì)胞單層融合度可以達(dá)到70-80%,即可開始試驗。
3.PBS洗細(xì)胞2次后,胰酶消化細(xì)胞2min,待細(xì)胞變圓后,用*培養(yǎng)基終止消化。
4.輕輕吹下細(xì)胞成單細(xì)胞懸液后,1200rpm室溫離心5min。
5.*棄去上清,根據(jù)細(xì)胞數(shù)量,加入適量的電轉(zhuǎn)緩沖液重懸細(xì)胞(一般為0.5-0.6ml左右),并上下吹打均勻。
6.加入適量相應(yīng)濃度的待轉(zhuǎn)染核酸至相應(yīng)的終濃度(質(zhì)粒為20ug/ml,SiRNA的終濃度為100nM),上下吹打均勻。若以0.5ml計算,所需質(zhì)粒為0.5×20=10ug。
7.將含有相應(yīng)濃度核酸的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移入相應(yīng)規(guī)格的電轉(zhuǎn)杯中,按照預(yù)定條件設(shè)置參數(shù),進(jìn)行電擊操作。
8.電擊完成后,將電轉(zhuǎn)杯置于恒溫培養(yǎng)箱中8-12min,以使核酸充分進(jìn)入細(xì)胞。
9.將電擊杯從恒溫培養(yǎng)箱中取出,接種細(xì)胞懸液于預(yù)熱的培養(yǎng)基中,上下吹打均勻后,置于培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。
10.正常培養(yǎng)4h,待細(xì)胞貼壁后,給細(xì)胞換新鮮的*培養(yǎng)基,以去除上層的死細(xì)胞。
11.培養(yǎng)24h后,即可進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的檢測或是進(jìn)行細(xì)胞的實驗處理。
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