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恒溫培養(yǎng)搖床蛋白質(zhì)表達(dá)和純化

更新時(shí)間:2024-11-01  |  點(diǎn)擊率:29

在實(shí)驗(yàn)室中,恒溫培養(yǎng)搖床在蛋白質(zhì)表達(dá)和純化過(guò)程中扮演著重要角色,尤其是在微生物表達(dá)系統(tǒng)中。以下是使用恒溫培養(yǎng)搖床進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)和純化的步驟:

蛋白質(zhì)表達(dá)

菌株選擇與轉(zhuǎn)化:

選擇適合的宿主菌株(如大腸桿菌、酵母等)。

通過(guò)轉(zhuǎn)化將含有目標(biāo)基因的表達(dá)載體引入到宿主細(xì)胞中。

接種與預(yù)培養(yǎng):

將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞接種到含有適當(dāng)抗生素的液體培養(yǎng)基中。

在恒溫培養(yǎng)搖床上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),使細(xì)胞適應(yīng)生長(zhǎng)條件并達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

誘導(dǎo)表達(dá):

向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑(如IPTG、乳糖、醇等),以啟動(dòng)基因表達(dá)。

將培養(yǎng)容器放回?fù)u床上,在適宜的溫度下繼續(xù)培養(yǎng),通常在幾個(gè)小時(shí)到過(guò)夜。

監(jiān)控表達(dá):

在誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中,可以取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析,以監(jiān)控蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。

蛋白質(zhì)純化

細(xì)胞收集:

表達(dá)完成后,通過(guò)離心將細(xì)胞從培養(yǎng)基中分離出來(lái)。

細(xì)胞裂解:

使用物理或化學(xué)方法(如超聲波破碎、高壓勻漿等)裂解細(xì)胞,釋放出蛋白質(zhì)。

初步純化:

根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì),可能需要經(jīng)過(guò)初步純化步驟,如鹽析、離心去除細(xì)胞碎片等。

親和層析:

如果蛋白質(zhì)帶有融合標(biāo)簽(如His標(biāo)簽、GST標(biāo)簽等),可以使用親和層析柱進(jìn)行純化。

將裂解液上樣到預(yù)裝好的親和層析柱上,通過(guò)特定的緩沖液洗滌非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。

洗脫與收集:

使用洗脫緩沖液將目標(biāo)蛋白質(zhì)從親和層析柱上洗脫下來(lái)。

收集洗脫液,并可能需要進(jìn)一步的純化步驟,如離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析等。

純度分析與鑒定:

使用SDS-PAGE、Western blotting、質(zhì)譜等技術(shù)對(duì)純化后的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析和鑒定。

在整個(gè)過(guò)程中,恒溫培養(yǎng)搖床確保了細(xì)胞在表達(dá)蛋白質(zhì)時(shí)的生長(zhǎng)條件穩(wěn)定,這對(duì)于蛋白質(zhì)的正確折疊和功能性至關(guān)重要。同時(shí),通過(guò)搖動(dòng)可以增加培養(yǎng)基中的溶氧量,有助于細(xì)胞生長(zhǎng)和提高蛋白質(zhì)的表達(dá)量。純化步驟通常在室溫或4°C進(jìn)行,因此不涉及搖床的使用。


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