一 細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理與技術(shù)

現(xiàn)代生物技術(shù)一般認(rèn)為包括基因工程技術(shù)、細(xì)胞工程技術(shù)、酶工程技術(shù)和發(fā)酵工程技術(shù)，而這些技術(shù)的發(fā)展幾乎都與細(xì)胞培養(yǎng)有密切關(guān)系，特別是在醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)更具有特殊的作用和價值。比如基因工程藥物或疫苗在研究生產(chǎn)過程中很多是通過細(xì)胞培養(yǎng)來實現(xiàn)的?；蚬こ桃腋我呙绾芏嗍且訡HO細(xì)胞作為載體；細(xì)胞工程中更是離不細(xì)胞培養(yǎng)，雜交瘤單克隆抗體，*是通過細(xì)胞培養(yǎng)來實現(xiàn)的，既使是現(xiàn)在飛速發(fā)展的基因工程抗體也離不開細(xì)胞培養(yǎng)。正在倍受重視的基因治療、體細(xì)胞治療也要經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)過程才能實現(xiàn)，發(fā)酵工程和酶工程有的也與細(xì)胞培養(yǎng)密切相關(guān)?？傊?，細(xì)胞培養(yǎng)在整個生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中起到了很關(guān)鍵的核心作用。

第①節(jié) 體外培養(yǎng)的概念

一、基本概念 體外培養(yǎng)（in vitro culture），就是將活體結(jié)構(gòu)成分或活的個體從體內(nèi)或其寄生體內(nèi)取出，放在類似于體內(nèi)生存環(huán)境的體外環(huán)境中，讓其生長和發(fā)育的方法。

組織培養(yǎng)：是指從生物體內(nèi)取出活的組織（多指組織塊）在體外進(jìn)行培養(yǎng)的方法。

細(xì)胞培養(yǎng)：是指將活細(xì)胞（尤其是分散的細(xì)胞）在體外進(jìn)行培養(yǎng)的方法。

器官培養(yǎng)：是指從生物體內(nèi)取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在體外進(jìn)行培養(yǎng)的方法。

二、體內(nèi)、外細(xì)胞的差異和分化

1、差異：細(xì)胞離體后，失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞間的相互影響，生活在缺乏動態(tài)平衡相對穩(wěn)定環(huán)境中，日久天長，易發(fā)生如下變化：分化現(xiàn)象減弱；形態(tài)功能趨于單一化或生存一定時間后衰退死亡；或發(fā)生轉(zhuǎn)化獲得不死性，變成可無限生長的連續(xù)細(xì)胞系或惡性細(xì)胞系。因此，培養(yǎng)中的細(xì)胞可視為一種在特定的條件下的細(xì)胞群體，它們既保持著與體內(nèi)細(xì)胞相同的基本結(jié)構(gòu)和功能，也有一些不同于體內(nèi)細(xì)胞的性狀。實際上從細(xì)胞一旦被置于體外培養(yǎng)后，這種差異就開始發(fā)生了。

2、分化：體外培養(yǎng)的細(xì)胞分化能力并未*喪失，只是環(huán)境的改變，細(xì)胞分化的表現(xiàn)和在體內(nèi)不同。細(xì)胞是否表現(xiàn)分化,關(guān)鍵在于是否存在使細(xì)胞分化的條件，如Friend細(xì)胞（小鼠紅白血病細(xì)胞）在一定的因素作用下可以合成血紅蛋白，血管內(nèi)皮細(xì)胞在類似基膜物質(zhì)底物上培養(yǎng)時能長成血管狀結(jié)構(gòu)，雜交瘤細(xì)胞能產(chǎn)生特異的單克隆抗體，這些均屬于細(xì)胞分化行為。

第二節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)的一般過程

一、準(zhǔn)備工作 準(zhǔn)備工作對開展細(xì)胞培養(yǎng)異常重要，工作量也較大，應(yīng)給予足夠的重視，推備工作中某一環(huán)節(jié)的疏忽可導(dǎo)致實驗失敗或無法進(jìn)行。準(zhǔn)備工作的內(nèi)容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無菌室或超凈臺的清潔與消毒，培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試。

二、取材 在無菌環(huán)境下從機(jī)體取出某種組織細(xì)胞（視實驗?zāi)康亩ǎ?，?jīng)過一定的處理（如消化分散細(xì)胞、分離等）后接入培養(yǎng)器血中，這一過程稱為取材。如是細(xì)胞株的擴(kuò)大培養(yǎng)則無取材這一過程。機(jī)體取出的組織細(xì)胞的*培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。

理論上講各種動物和人體內(nèi)的所有組織都可以用于培養(yǎng)，實際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個體的組織容易培養(yǎng)，分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng)，腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。取材后應(yīng)立即處理，盡快培養(yǎng)，因故不能馬上培養(yǎng)時，可將組織塊切成黃豆般大的小塊，置4℃的培養(yǎng)液中保存。取組織時應(yīng)嚴(yán)格保持無菌，同時也要避免接觸其他的有害物質(zhì)。取病理組織和皮膚及消化道上皮細(xì)胞時容易帶菌，為減少污染可用抗菌素處理。

三、培養(yǎng) 將取得的組織細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。如系組織塊培養(yǎng)，則直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部，幾個小時后組織塊可貼牢在底部，再加入培養(yǎng)基。如系細(xì)胞培養(yǎng)，一般應(yīng)在接入培養(yǎng)器皿之前進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，按要求以一定的量（以每毫升細(xì)胞數(shù)表示）接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細(xì)胞進(jìn)入培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞盡早進(jìn)入生長狀態(tài)。

正在培養(yǎng)中的細(xì)胞應(yīng)每隔一定時間觀察一次，觀察的內(nèi)容包括細(xì)胞是否生長良好，形態(tài)是否正常，有無污染，培養(yǎng)基的PH是否太酸或太堿（由酚紅指示劑指示），使用CO2培養(yǎng)箱此外對培養(yǎng)溫度和CO2濃度也要定時檢查。

原代培養(yǎng)一般有一段潛伏期（數(shù)小時到數(shù)十天不等），在潛伏期細(xì)胞一般不分裂，但可貼壁和游走。過了潛伏期后細(xì)胞進(jìn)入旺盛的分裂生長期。細(xì)胞長滿瓶底后要進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將一瓶中的細(xì)胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每傳代一次稱為“一代”。二倍體細(xì)胞一般只能傳幾十代，而轉(zhuǎn)化細(xì)胞系或細(xì)胞株則可無限地傳代下去。轉(zhuǎn)化細(xì)胞可能具有惡性性質(zhì)，也可能僅有不死性（Immortality）而無惡性。

四、凍存及復(fù)蘇（可參閱后面有關(guān)章節(jié)）為了保存細(xì)胞，特別是不易獲得的突變型細(xì)胞或細(xì)胞株，要將細(xì)胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度－196℃，將細(xì)胞收集至凍存管中加入含保護(hù)劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存，保存于液氮中。在極低的溫度下，細(xì)胞保存的時間幾乎是無限的。復(fù)蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入37℃水中，使之在一分鐘內(nèi)迅速融解。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進(jìn)行培養(yǎng)。

凍存過程中保護(hù)劑的選用、細(xì)胞密度、降溫速度及復(fù)蘇時溫度、融化速度等都對細(xì)胞活力有影響。

五、常用儀器設(shè)備 無菌室,超凈工作臺,三重純水蒸餾器,抽氣泵,壓力蒸氣消毒器,電熱恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)器具，CO2培養(yǎng)箱,恒溫水浴鍋,倒置顯微鏡,離心機(jī),無菌過濾器,洗刷裝置,細(xì)胞計數(shù)板和電子細(xì)胞技術(shù)儀等等。

第三節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境

一、無菌室

無菌室的結(jié)構(gòu)：一般由更衣間、緩沖間、操作間三部分組成。

無菌室的消毒和防污染：為保持無菌狀態(tài)，經(jīng)常消毒是必要的，通常采用每日（使用前）紫外照射（1－2小時），每周甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2小時）和每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進(jìn)行消毒。實際工作中，要根據(jù)無菌室建筑材料的差異來選擇合適的消毒方法。

此外，還應(yīng)注意防止無菌室的污染。造成無菌室污染的可能包括：送入無菌室的風(fēng)沒有被過濾除菌；進(jìn)出無菌室時，能使外界空氣直接對流進(jìn)無菌室的操作間；等。

二、超凈工作臺

工作原理：鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動空氣通過高效過濾器得以凈化，凈化的空氣被徐徐吹過臺面空間而將其中的塵埃、細(xì)菌甚至病毒顆粒帶走，使工作區(qū)構(gòu)成無菌環(huán)境。根據(jù)氣流在超凈工作臺的流動方向不同，可將超凈工作臺分為側(cè)流式、直流式和外流式三種類型。

超凈臺的使用與保養(yǎng)：超凈臺的平均風(fēng)速保持在0.32-0.48米/秒為宜，過大、過小均不利于保持凈化度；使用前建議開啟超凈臺內(nèi)紫外燈照射10－30分鐘，然后讓超凈臺預(yù)工作10－15分鐘，以除去臭氧和使用工作臺面空間呈凈化狀態(tài)；使用完畢后，要用70%酒精將臺面和臺內(nèi)四周擦拭干凈，以保證超凈臺無菌。還要定期用福爾馬林熏蒸超凈臺。

第四節(jié) 常用培養(yǎng)器皿及清洗消毒

細(xì)胞培養(yǎng)需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金屬器皿、塑料、橡膠制品、布類、紙類等，因此掌握清洗、消毒知識，學(xué)會清洗、消毒方法是從事細(xì)胞培養(yǎng)工作必須的。

一、清洗 離體條件下，有害物質(zhì)直接同細(xì)胞接觸，細(xì)胞對任何有害物質(zhì)十分敏感，極少殘留物都可以對細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必須認(rèn)真清洗，達(dá)到不含任何殘留物的要求。

（一）玻璃器皿的清洗 一般經(jīng)過浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四個步驟。

1、浸泡:新的或用過的玻璃器皿要先用清水浸泡，軟化和溶解附著物。新玻璃器皿使用前得先用自來水簡單刷洗，然后用5％鹽酸浸泡過夜；用過的玻璃器皿往往附有大量蛋白質(zhì)和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后應(yīng)立即浸入清水中備刷洗。

2、刷洗:將浸泡后的玻璃器皿放到洗滌劑水中，用軟毛刷反復(fù)刷洗。不要留死角，并防止破壞器皿表面的光潔度。將刷洗干凈的玻璃器皿洗凈、晾干，備浸酸。

3、浸酸:浸酸是將上述器皿浸泡到清潔液中，又稱酸液，通過酸液的強(qiáng)氧化作用清除器皿表面的可能殘留物質(zhì)。浸酸不應(yīng)少于六小時，一般過夜或更長。放取器皿要小心。

4、沖洗:刷洗和浸酸后的器皿都必須用水充分沖洗，浸酸后器皿是否沖洗的干凈，直接影響到細(xì)胞培養(yǎng)的成敗。手工洗滌浸酸后的器皿，每件器皿至少要反復(fù)“注水－倒空”15次以上，用重蒸水浸洗2－3次，晾干或烘干后包裝備用。

（二）橡膠制品清洗

新的橡膠制品洗滌方法：0.5mol/L NaOH煮沸15分鐘，流水沖洗，0.5mol/L HCl煮沸15分鐘，流水沖洗，自來水煮沸2次，蒸餾水煮沸20分鐘，50℃烤干備用。

（三）塑料制品的清洗

塑料制品特點：質(zhì)軟、易出現(xiàn)劃痕；耐腐蝕能力強(qiáng)、但不耐熱。

清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自來水過夜，用紗布或棉簽和50℃清洗液刷洗，流水沖洗，晾干，浸于清潔液15分鐘，流水沖洗（15－20遍）,蒸餾水浸洗三次，雙蒸水泡24小時，晾干備用。

（四）包裝:對細(xì)胞培養(yǎng)用品進(jìn)行消毒前，要進(jìn)行嚴(yán)密包裝，以便于消毒和貯存。常用的包裝材料：牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、較大培養(yǎng)皿等，近幾年用鋁箔包裝，非常方便，適用。培養(yǎng)皿、注射器、金屬器械等用牛皮紙包裝后再裝入飯盒內(nèi)，較大的器皿可以進(jìn)行局部包扎。

二、消毒和滅菌 微生物污染是造成細(xì)胞培養(yǎng)失敗的主要原因

（一）物理消毒法

1、紫外線消毒:紫外線是一種低能量的電磁輻射，可殺死多種微生物。革蘭陰性菌比較敏感，其次是陽性菌，再次為芽孢，真菌孢子的抵抗力較強(qiáng)。紫外線的直接作用是通過破壞微生物的核酸及蛋白質(zhì)等而使其滅活，間接作用是通過紫外線照射產(chǎn)生的臭氧殺死微生物。直接照射培養(yǎng)室消毒，用法簡單，效果好。

紫外燈的消毒效果同紫外燈的輻射強(qiáng)度和照射劑量呈正相關(guān)，輻射強(qiáng)度隨燈距離增加而降低，照射劑量和照射時間呈正比。因此紫外燈同被照射物的距離和照射時間要適合。離地面2米的30W燈可照射9平方米房間，每天照射2－3小時，期間可間隔30分鐘。燈管離地面2米以外要延長照射時間，2.5米照射效果較差。紫外燈照射工作臺的距離不應(yīng)超過1.5米，照射時間30分鐘為宜。

紫外燈不僅對皮膚、眼睛傷害，且對培養(yǎng)細(xì)胞與試劑等也產(chǎn)生不良影響，因此，不要開著紫外等操作。

2、高溫濕熱滅菌:壓力蒸汽滅菌是常用的高溫濕熱滅菌方法。對生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白質(zhì)變性凝固而使微生物死亡。布類、物、璃器皿、屬器皿、膠和某些培養(yǎng)液都可以用這方法滅菌。

不同壓力蒸汽所達(dá)到的溫度不同，不同消毒物品所需的有效消毒壓力和時間不同。從壓力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液體），應(yīng)立即放到60-70℃烤箱內(nèi)烘干，再貯存?zhèn)溆?，否則，潮濕的包裝物品表面容易為微生物污染。煮沸消毒也是常用的濕熱消毒方法，它具有條件簡單、使用方便等特點。

3、高溫干熱消毒：干熱滅菌主要是將電熱烤箱內(nèi)物品加熱到160℃以上，并保持90－120分鐘，殺死細(xì)菌和芽孢，達(dá)到滅菌目的。主要用于滅菌玻璃器皿（如體積較大的燒杯、培養(yǎng)瓶）、金屬器皿以及不能與蒸汽接觸的物品（如粉劑、油劑）。

干熱滅菌后要關(guān)掉開關(guān)并使物品逐漸冷卻后在打開，切忌立即打開，以免溫度驟變而使箱內(nèi)的玻璃器皿破裂。干烤箱內(nèi)物品間要有空隙，物品不要靠近加熱裝置。

燒灼也是滅菌方法之一，常利用臺面上的酒精燈的火焰對金屬器皿及玻璃器皿口緣進(jìn)行燒灼消毒。

4、過濾除菌：是將液體或氣體用微孔薄膜過濾，使大于孔徑的細(xì)菌等微生物顆粒阻留，從而達(dá)到除菌目的。在體外培養(yǎng)時，過濾除菌大多用于遇熱容易變性而失效的試劑或培養(yǎng)液。目前，大多實驗室采用微孔濾膜濾器除菌。關(guān)鍵步驟是安裝濾膜及無菌過濾過程。

（二）化學(xué)消毒：新潔而滅，其0.1％水溶液可對器械、皮膚、操作表面進(jìn)行擦拭和浸泡消毒。

（三）抗生素消毒：抗生素主要用于消毒培養(yǎng)液，是培養(yǎng)過程中預(yù)防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不嚴(yán)重時的“急救”方法。不同抗生素殺滅微生物不同，應(yīng)根據(jù)需要選擇。

可用于細(xì)胞培養(yǎng)的消毒滅菌方法很多，但每種方法都有一定的適應(yīng)范圍。如常用的過濾除菌系統(tǒng)、紫外照射、電子殺菌燈、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒實驗室空氣；多用新潔而滅消毒實驗室地面；常用干熱、濕熱消毒劑浸泡、紫外照射等方法消毒培養(yǎng)用器皿；采用高壓蒸汽滅菌或過濾除菌方法消毒培養(yǎng)液。

第二章 細(xì)胞培養(yǎng)液

現(xiàn)代生物技術(shù)均通過細(xì)胞作為載體來進(jìn)行，無論是基因治療、干細(xì)胞、克隆技術(shù)都在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的。細(xì)胞的生長需要一定的營養(yǎng)環(huán)境，用于維持細(xì)胞生長的營養(yǎng)基質(zhì)稱為培養(yǎng)基，即指所有用于各種目的的體外培養(yǎng)、保存細(xì)胞用的物質(zhì)，就其本意上講為人工模擬體內(nèi)生長的營養(yǎng)環(huán)境，使細(xì)胞在此環(huán)境中有生長和繁殖的能力。它是提供細(xì)胞營養(yǎng)和促進(jìn)細(xì)胞生長增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)。細(xì)胞培養(yǎng)基其組成成分主要有：水、氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)離子及其他一些入核酸降解物、激素等。

隨著動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的迅速發(fā)展，作為細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域中基本的原料－細(xì)胞培養(yǎng)基的用量也迅速增加，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)科和醫(yī)學(xué)研究的各個領(lǐng)域，如疫苗生產(chǎn)（人用疫苗如乙腦、狂犬、甲肝、乙肝、出血熱、麻疹等，獸用疫苗如口蹄、馬立克、偽狂犬等），基因藥物生產(chǎn)（如EPO、TPA等），臨床用單抗（如抗人肝癌單抗、抗人肺單抗、WT3）等。

第①節(jié) 水與平衡鹽溶液

1、培養(yǎng)用水:體外培養(yǎng)的細(xì)胞對水質(zhì)特別敏感，對水的純度要求較高。培養(yǎng)用水中如果含有一些雜質(zhì)，即使含量極微，有時也會影響細(xì)胞的存活和生長，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。用金屬蒸餾器制備的蒸餾水，可能會含有某些金屬離子，一般不作為培養(yǎng)用水。配制培養(yǎng)用液應(yīng)使用經(jīng)石英玻璃蒸餾器三次蒸餾的三蒸水或超純水凈化裝置制備的超純水。建議用瓶貯存，存放時間一般不應(yīng)超過2周。

2、緩沖溶液、生理鹽水、平衡鹽溶液：稍后介紹。

第二節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)基的基本要求

體外培養(yǎng)的細(xì)胞直接生活在培養(yǎng)基中，因此培養(yǎng)基應(yīng)能滿足細(xì)胞對營養(yǎng)成分、促生長因子、激素、滲透壓、pH等諸多方面的要求。

一、營養(yǎng)成分 維持細(xì)胞生長的營養(yǎng)條件一般包括以下幾個方面：

1、氨基酸：是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的原料。所有細(xì)胞都需要12種必須氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸。此外還需要谷氨酰胺，它在細(xì)胞代謝過程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的來源，同樣也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物質(zhì)。 體外培養(yǎng)的各種培養(yǎng)基內(nèi)都含有必需氨基酸。

2、單糖：培養(yǎng)中的細(xì)胞可以進(jìn)行有氧與無氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。細(xì)胞對葡萄糖的吸收能力較高，半乳糖較低。

體外培養(yǎng)動物細(xì)胞時，幾乎所有的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。

3、維生素：主要扮演輔酶、輔基的角色，*。生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素B12都是培養(yǎng)基常有的成分。

4、無機(jī)離子與微量元素：細(xì)胞生長除需要鈉、鉀、鈣、鎂、氮和磷等基本元素，還需要微量元素，如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩等。

二、促生長因子及激素 已證實：各種激素、生長因子對于維持細(xì)胞的功能、保持細(xì)胞的狀態(tài)（分化或未分化）具有十分重要的作用。有些激素對許多細(xì)胞生長有促生長作用，如胰島素，它能促進(jìn)細(xì)胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素對某一類細(xì)胞有明顯促進(jìn)作用，如可的索可促進(jìn)表皮細(xì)胞的生長，泌乳素有促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞生長作用等。

三、滲透壓 細(xì)胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞對滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓290mOsm/kg, 可視為培養(yǎng)人體細(xì)胞的理想滲透壓。鼠細(xì)胞滲透壓在320mOsm/kg左右。對于大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞，滲透壓在260－320mOsm/kg的范圍都適宜。

四、pH 氣體也是細(xì)胞生存的必需條件之一，所需氣體豐要是氧和二氧化碳。氧參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量供給細(xì)胞生長、增殖和合成各種成分。一些細(xì)胞在缺氧情況下，借糖酵解也可獲取能量，但多數(shù)細(xì)胞缺氧不能生存。在開放培養(yǎng)時，一般置細(xì)胞于95％空氣加5％二氧化碳的混合氣體環(huán)境中培養(yǎng)。二氧化碳既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也是細(xì)胞所需成分，它主要與維持培養(yǎng)基的pH有直接關(guān)系。動物細(xì)胞大多數(shù)需要輕微的堿性條件，pH值約在7．2~7．4℃在細(xì)胞生長過程中，隨細(xì)胞數(shù)量的增多和代謝活動的加強(qiáng)，二氧化碳不斷被釋放，培養(yǎng)液變酸，PH值發(fā)生變化。由于NaHCO3容易分解為二氧化碳，很不穩(wěn)定，致使緩沖系統(tǒng)難以準(zhǔn)確地控制。故這一緩沖系統(tǒng)適合密閉培養(yǎng)。HEPES結(jié)合碳酸氫鈉使用，可提供更有效的緩沖體系，主要是防止pH值迅速變動，但缺點是在開放培養(yǎng)或觀察時難以維持正常的pH值。造成pH波動主要是代謝產(chǎn)生的CO2 ，在封閉式培養(yǎng)過程中CO2與水結(jié)合產(chǎn)生碳酸，培養(yǎng)基pH很快下降。為解決這一問題，合成培養(yǎng)基中使用了NaHCO3-CO2緩沖系統(tǒng)，并采用開放培養(yǎng)，使細(xì)胞代謝產(chǎn)生的CO2及時溢出培養(yǎng)瓶，再通過穩(wěn)定調(diào)節(jié)溫箱中CO2 濃度（5％），與培養(yǎng)基中的NaHCO3處于平衡狀態(tài)。

五、無毒、無污染 體外生長的細(xì)胞對微生物及一些有害有毒物質(zhì)沒有抵抗能力，因此培養(yǎng)基應(yīng)達(dá)到無化學(xué)物質(zhì)污染、無微生物污染（如細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等）、無其他對細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染（如抗體、補(bǔ)體）。對于天然培養(yǎng)基，污染主要來源于取材過程及生物材料本身，應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格選材，嚴(yán)格操作。對于合成培養(yǎng)基，污染主要來源于配制過程，配制所用的水，器皿應(yīng)十分潔凈，配制后應(yīng)嚴(yán)格過濾除菌。

第三節(jié) 天然細(xì)胞培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基是指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養(yǎng)技術(shù)建立早期，體外培養(yǎng)細(xì)胞都是利用天然培養(yǎng)基。但是由于天然培養(yǎng)基制作過程復(fù)雜、批間差異大，因此逐漸為合成培養(yǎng)基所替代。目前廣泛使用的天然培養(yǎng)基是血清，另外各種組織提取液、促進(jìn)細(xì)胞貼壁的膠原類物質(zhì)在培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞也是*。

一、血清(serum)細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展，培養(yǎng)基的質(zhì)量又是關(guān)鍵，而培養(yǎng)基的主要成份中動物血清對細(xì)胞的生長繁殖發(fā)揮著重要甚至是難以替代的作用。在動物血清的應(yīng)用中牛血清又是較為廣泛的，所以血清是醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品中重要的原材料之一。保證血清質(zhì)量也是促進(jìn)生物制品質(zhì)量提高的重要環(huán)節(jié)。

1、血清種類:目前用于組織培養(yǎng)的血清主要是牛血清，培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞也用人血清、馬血清等。選擇用牛血清培養(yǎng)細(xì)胞的原因：來源充足、制備技術(shù)成熟、經(jīng)過長時間的應(yīng)用考驗人們對其有比較深入的理解。牛血清對絕大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞都是適合的，但并不排除在培養(yǎng)某種細(xì)胞時使用其他動物血清更合適。

牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)中用量很大的天然培養(yǎng)基，含有豐富的細(xì)胞生長必須的營養(yǎng)成份，具有極為重要的功能。牛血清分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛；新牛血清取自出生24小時之內(nèi)的新生牛；小牛血清取自出生10－30天的小牛。顯然，胎牛血清是品質(zhì)較高的，因為胎牛還未接觸外界，血清中所含的抗體、補(bǔ)體等對細(xì)胞有害的成分較少。

2、血清的主要成分:血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復(fù)雜的混合物，其組成成份雖大部分已知，但還有一部分尚不清楚，且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養(yǎng)條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機(jī)物等，這些物質(zhì)對促進(jìn)細(xì)胞生長或抑制生長活性是達(dá)到生理平衡的。對血清的成分和作用的研究雖有很大進(jìn)展，但仍存在一些問題。主要是：

第①一:血清的成份可能有幾百種之多，目前對其準(zhǔn)確的成份、含量及其作用機(jī)制仍不清楚，尤其是對其中一些多肽類生長因子、激素和脂類等尚未充分認(rèn)識，這給研究工作帶來許多困難；

第二:血清都是批量生產(chǎn)，各批量之間差異很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保證每批血清的相似性極為困難，從而使實驗的標(biāo)準(zhǔn)化和連續(xù)性受到限制；

第三:不能排除血清中含有易變物質(zhì)，這被認(rèn)為是“瓶中惡化”的原因之一。

3、血清主要作用：

提供基本營養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、維生素、無機(jī)物、脂類物質(zhì)、核酸衍生物等，是細(xì)胞生長必須的物質(zhì)。

提供激素和各種生長因子：胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素（可的索、地塞米松）、類固醇激素（雌二醇、睪酮、孕酮）等。生長因子如成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等。

提供結(jié)合蛋白：結(jié)合蛋白作用是攜帶重要地低分子量物質(zhì)，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉(zhuǎn)鐵蛋白攜帶鐵。結(jié)合蛋白在細(xì)胞代謝過程中起重要作用。

提供促接觸和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷。

對培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用：有一些細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓樣細(xì)胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。這種作用是偶然發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)在則有目的的使用血清來終止胰蛋白酶的消化作用。因為胰蛋白酶已經(jīng)被廣泛用于貼壁細(xì)胞的消化傳代。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷，特別是在懸浮培養(yǎng)攪拌時，粘度起到重要作用。血清還含有一些微量元素和離子，他們在代謝解毒中起重要作用，如SeO3,硒等。

4、細(xì)胞培養(yǎng)中使用血清的缺點

血清成分復(fù)雜，雖含許多對細(xì)胞有利成分，也含有對細(xì)胞有害的成分，使血清有幾個明顯的缺點：

對大多數(shù)細(xì)胞，在體內(nèi)狀態(tài)，血清不是它們接觸的生理學(xué)液體，只是在損傷愈合以及血液凝固過程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種細(xì)胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)，血清可能促進(jìn)某些細(xì)胞的生長（成纖維細(xì)胞）同時抑制另一類細(xì)胞生長（表皮細(xì)胞）。

血清含一些對細(xì)胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì)，如多胺氧化酶，能與來自高度繁殖細(xì)胞的多胺反應(yīng)（如精胺、亞精胺）形成有細(xì)胞毒性作用的聚精胺。補(bǔ)體、抗體、細(xì)菌毒素等都會影響細(xì)胞生長，甚至造成細(xì)胞死亡。

動物個體不同，血清產(chǎn)地、批號不同，每批質(zhì)量差異甚大，其成分不能保持一致。

取材中可能帶入支原體、病毒，對細(xì)胞產(chǎn)生潛在影響，可能導(dǎo)致實驗失敗或?qū)嶒灲Y(jié)果不可靠性。

血清的使用使得實驗和生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化困難，其中的蛋白質(zhì)使得某些轉(zhuǎn)基因蛋白生物藥品生產(chǎn)中分離純化工作很難完成。

大規(guī)模生產(chǎn)中，血清來源越來越困難，價格昂貴，是構(gòu)成動物細(xì)胞培養(yǎng)對生產(chǎn)成本的主要部分之一。

5、血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn):血清質(zhì)量高低取決于兩方面因素：一是取材對象，二是取材過程。用于取材的動物應(yīng)健康無病并且在預(yù)計的出生天數(shù)之內(nèi)，取材過程應(yīng)嚴(yán)格按照操作規(guī)程執(zhí)行，制備出的血清要經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量鑒定。WHO公布的《用動物細(xì)胞體外培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品規(guī)程》中的要求：

牛血清必須來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家。并應(yīng)具備適當(dāng)?shù)谋O(jiān)測系統(tǒng)。

有些國家還要求牛血清來自未用過反芻動物蛋白飼料的牛群。

證明所用牛血清中不含對所生產(chǎn)疫苗病毒的抑制物。

血清要通過濾膜過濾除菌，保證無菌。

無細(xì)菌、霉菌、支原體和病毒的污染，有些國家要求無細(xì)菌噬菌體污染。

對細(xì)胞有良好的支持繁殖作用。

我國在對牛血清的質(zhì)量2000年版《中國生物制品主要原輔料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》中提出比較嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)要求。包括蛋白質(zhì)含量，細(xì)菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細(xì)菌內(nèi)毒素，支持細(xì)胞增殖檢查。

血清質(zhì)量的鑒定一般包括以下幾個方面：

理化性質(zhì)：如滲透壓、pH值、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素水平、內(nèi)毒素等。蛋白含量包括血清總蛋白含量（不低于35-45g/L）、球蛋白含量（應(yīng)小于20g/L)、血紅蛋白含量等。其中球蛋白含量是一項非常重要的指標(biāo)，血清中球蛋白主要是抗體，球蛋白含量越低血清質(zhì)量越高。血紅蛋白也是越低越好。

微生物檢測：包括細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等。特別是對支原體、病毒的檢測，支原體是一種很小的微生物，可通過孔徑22u的濾膜。支原體、病毒污染在光學(xué)顯微鏡下難于察覺，細(xì)胞也能生長繁殖，但會影響實驗結(jié)果。檢測支原體的方法很多，如培養(yǎng)法、PCR法、熒光染色法、電鏡觀察法等。

促生長效果：這是血清重要的特性之一，應(yīng)當(dāng)以培養(yǎng)的細(xì)胞來檢測。有兩種方法：克隆形成率、貼瓶率測定法和連續(xù)傳代培養(yǎng)法。

(1)克隆形成率測定：一般以懸浮生長的細(xì)胞為培養(yǎng)對象，按有限稀釋法做克隆化培養(yǎng)，將不同批號的血清配制成不同濃度的培養(yǎng)基，細(xì)胞也稀釋成不同濃度，接種到96孔板，每孔200ul，培養(yǎng)一定時間，統(tǒng)計有克隆生長的孔，計算出百分比，再與對照的標(biāo)準(zhǔn)血清相比較，就可看出不同批號血清間的區(qū)別。比較低的濃度，更能觀察出血清質(zhì)量間的細(xì)微差別。

(2)貼瓶率測定：是以貼壁細(xì)胞為培養(yǎng)對象，將細(xì)胞稀釋至低密度，接種至平皿，每皿200或100個細(xì)胞，以不同濃度的血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)一定時間后棄培養(yǎng)基，染色后統(tǒng)計集落數(shù)，計算出集落數(shù)占接種細(xì)胞數(shù)的百分比，同樣再與標(biāo)準(zhǔn)血清比較，判斷血清質(zhì)量高低。

(3)連續(xù)傳代培養(yǎng)法：是將細(xì)胞培養(yǎng)于3個一定體積的培養(yǎng)瓶中，待測血清配制為5％濃度，一般于第七天收集細(xì)胞，計數(shù)，取平均值，中間可以更換一次培養(yǎng)基。連續(xù)測試三個周期以上，觀察細(xì)胞生長狀況，并將每次的計數(shù)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)血清的測試結(jié)果比較。

對于使用者，判斷血清質(zhì)量先從外觀入手。好的血清應(yīng)該是透明清亮，土黃色或棕黃色，無沉淀或極少沉淀，比較粘稠。如發(fā)現(xiàn)血清渾濁、不透明、含許多沉淀物，說明血清污染或血清中的蛋白質(zhì)變性；若血清呈棕紅色，說明血清中的血紅蛋白含量太高，取材時有溶血現(xiàn)象；如果搖晃時感覺液體稀薄，說明血清中摻入的生理鹽水太多。如果要進(jìn)一步了解血清的質(zhì)量，則應(yīng)連續(xù)培養(yǎng)某些細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長狀況。

6、血清的使用與儲存:正確的使用及保存血清，才能使血清發(fā)揮應(yīng)有的作用。

使用前處理：大部分血清在使用前必須滅活處理，即56℃30分鐘。滅活的目的是去除血清中的補(bǔ)體成分，避免補(bǔ)體對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。血清經(jīng)過滅活也會損失一些對細(xì)胞有利的成分，如生長因子，因此也有人提出血清不經(jīng)滅活直接用于培養(yǎng)，這樣做的前提是確認(rèn)血清中不含補(bǔ)體成分。對于一些品質(zhì)高的胎牛血清和新牛血清可以考慮不經(jīng)滅活直接用于細(xì)胞培養(yǎng)。

儲存條件：血清一般儲存于－20℃，同時應(yīng)避免反復(fù)凍融。購買大包裝的血清后，首先要滅活處理，然后分裝成小包裝，儲存于－20℃，使用前融化。融化時現(xiàn)置于4℃。融化后的血清在4℃不宜長時間存放，應(yīng)盡快使用。

使用濃度：自從有了合成培養(yǎng)基，血清就是作為一種添加成分與合成培養(yǎng)基混合使用，使用濃度一般為5－20％，常用是10％。過多血清容易使培養(yǎng)中的細(xì)胞發(fā)生變化，特別是一些二倍體的無限細(xì)胞系，迅速生長之后容易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。 采購血清時，先從供應(yīng)商處索取樣品進(jìn)行試驗，選定一批后就要保留足夠使用6個月至1年的量，直至用另一批經(jīng)過預(yù)先試驗的樣品代替。

二、胚胎浸出液

胚胎浸出液(embryonic extract)是早期動物細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用的天然培養(yǎng)基，現(xiàn)已很少使用。

三、水解乳蛋白 水解乳蛋白(lactalbumin hydrolysate)為乳白蛋白經(jīng)蛋白酶和肽酶水解的產(chǎn)物，含有豐富的氨基酸，是常用的天然培養(yǎng)基，可用于許多細(xì)胞和原代細(xì)胞的培養(yǎng)。

第四節(jié) 合成細(xì)胞培養(yǎng)基

合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學(xué)物質(zhì)模擬合成、人工設(shè)計、配制的培養(yǎng)基。它有一定的配方，是一種理想的培養(yǎng)基。目前合成培養(yǎng)基多達(dá)10多余種，有的培養(yǎng)基仍在不斷進(jìn)行改良。早期組織培養(yǎng)是利用天然培養(yǎng)基，目前合成培養(yǎng)基已經(jīng)成為一種標(biāo)準(zhǔn)化的商品，從簡單的基本培養(yǎng)基發(fā)展到無血清培養(yǎng)基、無蛋白培養(yǎng)基，并且還在不斷發(fā)展。合成培養(yǎng)基的出現(xiàn)促進(jìn)了組織培養(yǎng)技術(shù)的普及發(fā)展。

一、基本組分 基本培養(yǎng)基包括四大類物質(zhì)：無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物。

無機(jī)鹽：CaCl2 KCl MgSO4 NaCl NaHCO3 NaH2PO4。對調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓、某些酶的活性及溶液的酸堿度都是必須的。

氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)。它們都是細(xì)胞用以合成蛋白質(zhì)的必需原料，不能由其他氨基酸或糖類轉(zhuǎn)化合成。除此之外，還需要谷氨酰胺(glutamine)。谷氨酰胺具有特殊的作用，對細(xì)胞的培養(yǎng)特別重要，能促進(jìn)各種氨基酸進(jìn)入細(xì)胞膜；它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的來源，還是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏可導(dǎo)致細(xì)胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。值得注意的是：谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，故4℃下放置1周可分解50%，使用中建議單獨配制，置-20℃冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液中。

維生素：是維持細(xì)胞生長的一種生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞中大多形成酶的輔基或輔酶，對細(xì)胞代謝有重大影響。脂溶性維生素(A、D、E、K)常從血清中得到補(bǔ)充。水溶性維生素包括牛物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素和B12。維生素C也是*的，對具有合成膠原能力的細(xì)胞更為重要。

碳水化合物：是細(xì)胞生命的能量來源，有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖和丙酮酸鈉等。體外培養(yǎng)動物細(xì)胞時，幾乎所有培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。

葡萄糖和谷胺酰胺的合理使用：乳酸是葡萄糖不*氧化的產(chǎn)物。研究表明，體外培養(yǎng)條件下95％的葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?，這降低了營養(yǎng)物質(zhì)的代謝效率，降低培養(yǎng)基pH值，增加滲透壓。在氧氣供給不足的情況下，NADH轉(zhuǎn)運系統(tǒng)蘋果酸－天冬氨酸穿梭系統(tǒng)活性低而不能將糖酵解產(chǎn)生的NADH氧化磷酸化為NAD+，細(xì)胞只得以降低能量需求的方式如激活乳酸脫氫酶將糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸與NADH反應(yīng)生產(chǎn)乳酸和NAD+，從而保證了糖酵解的順利進(jìn)行。另一個可能的解釋是連接糖酵解與TCA循環(huán)的特異性酶如丙酮酸脫氫酶復(fù)合物、磷酸丙酮酸羧化酶激酶和丙酮酸羧化酶活性低下，直接導(dǎo)致糖酵解與TCA循環(huán)的失衡。因此體外培養(yǎng)條件下，葡萄糖主要經(jīng)糖酵解降解，產(chǎn)生過量的乳酸。減少乳酸生產(chǎn)常用的方法是限制培養(yǎng)基中葡萄糖的含量，但葡萄糖含量過低可造成細(xì)胞營養(yǎng)供應(yīng)不足，細(xì)胞生長抑制。該方法需要對葡萄糖的消耗與需求、乳酸的生產(chǎn)速率以及目的蛋白的表達(dá)量等參數(shù)進(jìn)行綜合考慮方可應(yīng)用。

在目前常用的培養(yǎng)基中，葡萄糖和谷胺酰胺是體外培養(yǎng)動物細(xì)胞的主要能源，其能量代謝通路與體內(nèi)*不同，表現(xiàn)為葡萄糖主要經(jīng)糖酵解途徑為細(xì)胞提供能量，谷胺酰胺大部分通過不*氧化途徑，另一小部分通過*氧化為細(xì)胞供能。因此，適當(dāng)?shù)恼{(diào)整細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑，使之能促進(jìn)細(xì)胞的快速生長和產(chǎn)物合成，同時減少代謝抑制物的生成是行之有效的一種策略。

許多動物細(xì)胞如CHO、BHK和雜交瘤細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)葡萄糖和谷氨酰胺的消耗利用很快。然而對于細(xì)胞生長而言，二者的快速利用并非細(xì)胞必需；相反相當(dāng)一部分轉(zhuǎn)化為代謝廢物乳酸和氨，以及一些非必需氨基酸如丙氨酸，脯氨酸。其中，乳酸和氨是兩種主要代謝廢物，其積累可影響細(xì)胞生長以及產(chǎn)品質(zhì)量。減少這兩種代謝產(chǎn)物的積累，是大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究的重要方向。

氨是由谷氨酰胺和天冬酰胺產(chǎn)生的。限制培養(yǎng)基中谷氨酰胺的含量亦是減少氨生成的常用方法。

除了以上與細(xì)胞生長有關(guān)的物質(zhì)以外，培養(yǎng)基中一般還要加入酚紅（當(dāng)溶液酸性時pH小于6.8呈黃色；當(dāng)溶液堿性時pH大于8.4呈紅色），一種pH指示劑。

在較為復(fù)雜的培養(yǎng)液中還包括核酸降解物(如嘌呤和嘧啶兩類)以及氧化還原劑(如谷胱甘肽)等。有的培養(yǎng)液還直接采用了三磷酸腺苷和輔酶A。

二、常用細(xì)胞培養(yǎng)基

(1)MEM細(xì)胞培養(yǎng)基系列

(2)DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基系列

(3)RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基系列

(4)199細(xì)胞培養(yǎng)基系列

(5)水解乳蛋白細(xì)胞培養(yǎng)基

(6)歐氏平衡鹽

(7)F-10,F-12細(xì)胞培養(yǎng)基系列

(8)其它類型細(xì)胞培養(yǎng)基

三、干粉培養(yǎng)基的配制

配制培養(yǎng)基要注意以下問題：

認(rèn)真閱讀說明書。說明書都注明干粉不包含的成分，常見的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些是必須添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根據(jù)實驗需要決定。

配制是要保證充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物質(zhì)都要等培養(yǎng)基*溶解之后才能添加。

配制所用的水應(yīng)是三蒸水，離子濃度很低。

所用器皿應(yīng)嚴(yán)格消毒。

配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過濾，無菌保存于4度。

液體培養(yǎng)基主要是為了科研工作的方便而設(shè)計的培養(yǎng)基，它是一種滅菌后保證無菌的溶液，必要時可制成無內(nèi)毒素等的溶液，可節(jié)省科研人員的工作量。

配制方法

在一個盡可能接近總體積的容器中加入比預(yù)期培養(yǎng)基總體積少5％的雙蒸水。

在室溫（20℃到30℃）的水中加入干粉培養(yǎng)基，輕輕攪拌，不要加熱。

水洗包裝袋的內(nèi)部，轉(zhuǎn)移全部的痕量干粉到容器內(nèi)。

加NaHCO3到培養(yǎng)基中。

用雙蒸水稀釋到想要的體積，攪拌溶解。注意不要過分?jǐn)嚢琛?/p>

通過緩慢攪拌加入1N NaOH 或1N HCL調(diào)節(jié)pH值，由于pH值在過濾時會上升0.1到0.3，因而調(diào)節(jié)pH值使它比想要的pH值低0.2到0.3。培養(yǎng)基在過濾前要保持密封。

第五節(jié) 無血清技術(shù)及其培養(yǎng)基

經(jīng)歷了天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基后，無血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)成為當(dāng)今細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的一大趨勢。采用無血清培養(yǎng)可降低生產(chǎn)成本，簡化分離純化步驟，避免病毒污染造成的危害。

無血清培養(yǎng)基(serum free medium,SFM):是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個別蛋白或大量蛋白組分。雖然基礎(chǔ)培養(yǎng)基加少量血清所配制的*培養(yǎng)基可以滿足大部分細(xì)胞培養(yǎng)的要求，但對有些實驗卻不適合，如觀察一種生長因子對某種細(xì)胞的作用，這時需要排除其他生長因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長因子；又如需要測定某種細(xì)胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質(zhì)（抗體、生長因子）的能力；或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細(xì)胞，以獲得它們的分泌產(chǎn)物。因此研制出無血清培養(yǎng)基一直是生物科學(xué)工作者努力的目標(biāo)。上海恒利安生物科技有限公司已成功開發(fā)了商業(yè)化的多種無血清培養(yǎng)基，可滿足眾多廠商的需求。

一、無血清培養(yǎng)基的基本配方:基本成分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。

用于生物制藥和疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞在體外培養(yǎng)時，多數(shù)呈貼壁生長或兼性貼壁生長；而當(dāng)其在無血清、無蛋白培養(yǎng)基中生長時，由于缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白，細(xì)胞往往以懸浮形式生長。

添加組分包括以下幾大類物質(zhì)：

(1）促貼壁物質(zhì)：許多細(xì)胞必須貼壁才能生長，這種情況下無血清培養(yǎng)基中一定要添加促貼壁和擴(kuò)展因子，一般為細(xì)胞外基質(zhì)，如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細(xì)胞功能的分化因子，對許多細(xì)胞的繁殖和分化，起著重要作用。纖連蛋白主要促進(jìn)來自中胚層細(xì)胞的貼壁與分化，這些細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、肉瘤細(xì)胞、粒細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、CHO細(xì)胞、成肌細(xì)胞等。

(2）促生長因子及激素：針對不同細(xì)胞添加不同的生長因子。激素也是刺激細(xì)胞生長、維持細(xì)胞功能的重要物質(zhì)，有些激素是許多細(xì)胞*的，如胰島素。

(3）酶抑制劑：培養(yǎng)貼壁生長的細(xì)胞，需要用胰酶消化傳代，在無血清培養(yǎng)基中*須含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。常用的是大豆胰酶；抑制劑。

(4）結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運蛋白：常見如轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比較大，可增加培養(yǎng)基的粘度，保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷。許多旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基都含有牛血清白蛋白。

(5)微量元素：硒是較常見的。

二、使用方法:目前，血清仍是動物細(xì)胞培養(yǎng)中基本的的添加物，尤其是在原代培養(yǎng)或者細(xì)胞生長狀況不良時，常常會先使用有血清的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長旺盛以后，再換成無血清培養(yǎng)液。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)要有一個適應(yīng)過程，一般要逐步降低血清濃度，從10%減少到5%，3%，1%，直至無血清培養(yǎng)。在降低過程中要注意觀察細(xì)胞形態(tài)是否發(fā)生變化，是否有部分細(xì)胞死亡，存活細(xì)胞是否還保持原有的功能和生物學(xué)特性等。在實驗后這些細(xì)胞一般不再繼續(xù)保留，很少有細(xì)胞能夠長期培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基而不發(fā)生改變的。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)之前，要留有種子細(xì)胞，種子細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)于含血清的培養(yǎng)基中，以保證細(xì)胞的特性不發(fā)生變化。

為了使細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)，關(guān)鍵的是使所培養(yǎng)細(xì)胞：

處于對數(shù)生長中期

>90% 活細(xì)胞率

適應(yīng)時以較高的起始細(xì)胞接種

有兩種方法使細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)基（SFM）:

1、直接適應(yīng)——細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基（SFM）中。

一些類型細(xì)胞可直接從包含血清的培養(yǎng)基適應(yīng)無血清培養(yǎng)基。對于直接適應(yīng)，接種細(xì)胞密度應(yīng)該:2.5×105~3.5×105細(xì)胞/ml。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×106~3×106細(xì)胞/ml時，傳代培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞密度在培養(yǎng)4到7天后達(dá)到2×106~4×106細(xì)胞/ml時，細(xì)胞*適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基。每隔3~5天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×106~3×106細(xì)胞/ml，細(xì)胞活率在90％時，貯備的適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。

2、連續(xù)適應(yīng)——分好幾步把細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基（SFM）中，與直接適應(yīng)相比較，連續(xù)適應(yīng)趨向?qū)τ诩?xì)胞更加溫和一些。

以2倍正常接種密度接種生長活躍的細(xì)胞培養(yǎng)物到75%有血清培養(yǎng)基：25％SFM 混合培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)。

當(dāng)細(xì)胞密度>5×105細(xì)胞/ml時，以2×105到3×105細(xì)胞/ml細(xì)胞密度，在有血清培養(yǎng)基：SFM為50∶50的混合培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

以2×106到3×106細(xì)胞/ml細(xì)胞密度，25％有血清培養(yǎng)基和75% SFM中傳代培養(yǎng)。

當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×106到3×106細(xì)胞/ml（接種后4到6天），在100％SFM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

每隔3到5天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×106到3×106細(xì)胞/ml，細(xì)胞活率在90％時，貯備的適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。

建議備份前一次混合培養(yǎng)的培養(yǎng)物，直到每一次細(xì)胞適應(yīng)了新的混合培養(yǎng)基。每一次減少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培養(yǎng)基中進(jìn)行幾次傳代。

在適應(yīng)過程中，建議不要讓細(xì)胞生長過度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意，與有血清培養(yǎng)基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白質(zhì)，因而更易于受外界因素的影響。

細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)替代血清：許多細(xì)胞利用連續(xù)適應(yīng)方法能很好的適應(yīng)，用包含F(xiàn)BS的的培養(yǎng)基和包含有替代血清的培養(yǎng)基1∶1（v∶v）的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。通過下列的混合培養(yǎng)基的方式，連續(xù)幾代減少當(dāng)前培養(yǎng)基的量：1∶2，1∶4，1∶16和100％替代培養(yǎng)基。每次適應(yīng)改變血清比例時，傳代細(xì)胞2到3次。

培養(yǎng)可以直接從FBS轉(zhuǎn)換到替代血清。一開始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清，生長的延遲可能會發(fā)生，4允許進(jìn)行2到3次的傳代，使生長率恢復(fù)到以前的水平。

特別需要強(qiáng)調(diào)的是：配制無血清培養(yǎng)液必須使用高質(zhì)量的水，如石英玻璃蒸餾器經(jīng)三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因為無血清培養(yǎng)基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護(hù)細(xì)胞的大分子，既便水中的有毒物質(zhì)含量甚微，也可能對細(xì)胞產(chǎn)生致死性損害。這是無血清培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一。

三、使用無血清培養(yǎng)基的優(yōu)點

增加確定性

性能更加一致

容易進(jìn)行純化和下游加工

細(xì)胞功能的準(zhǔn)確評估

增強(qiáng)生長和/或產(chǎn)量

生理反應(yīng)性的較好對照

增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)中介物的檢測

第六節(jié) 無蛋白培養(yǎng)基與限定化學(xué)成分培養(yǎng)基

一、無蛋白培養(yǎng)基（protein free midium,PFM）：即不含有動物蛋白的培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基仍含有較多的動物蛋白，如胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白等。從生物技術(shù)發(fā)展的趨勢來看，不含動物蛋白的培養(yǎng)基又廣泛的應(yīng)用前景，許多利用基因工程技術(shù)重組的蛋白質(zhì)應(yīng)用于人體，如果再生長過程中使用了含有動物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基，純化過程就比較復(fù)雜，要達(dá)到一定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也有一定的難度。無蛋白培養(yǎng)基就是為了適應(yīng)這發(fā)展趨勢而出現(xiàn)的，許多無蛋白培養(yǎng)基添加了植物水解物以替代動物激素、生長因子的作用。市場上已有適合多種細(xì)胞生長的無蛋白培養(yǎng)基。

二、限定化學(xué)成分培養(yǎng)基(chemical defined medium,CDM)：是指培養(yǎng)基中的素有成分都是明確的，它同樣不含有動物蛋白，同樣也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知結(jié)構(gòu)與功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。這種培養(yǎng)基更有利于分析細(xì)胞的分泌產(chǎn)物。目前已經(jīng)有適合于293細(xì)胞、CHO細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞生長的CDM問世，上海恒利安生物科技有限公司生產(chǎn)的水解乳蛋白培養(yǎng)基就屬于CDM。

第七節(jié) 其他細(xì)胞培養(yǎng)用液

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，除了培養(yǎng)基外，還經(jīng)常用到一些平衡鹽溶液、消化液、pH調(diào)整液等。

一、平衡鹽溶液（balanced salt solution,BSS）：主要是由無機(jī)鹽、葡萄糖組成，它的作用是維持細(xì)胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng)。主要用于取材時組織塊的漂洗、細(xì)胞的漂洗、配制其他試劑等。常規(guī)的BSS是Ringer。D-Hank's與Hank's的一個主要區(qū)別是前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hank's常用于配制胰酶溶液。Earle平衡液含有較高的NaHCO3(2.2g/L),適合于5%CO2 的培養(yǎng)條件，Hank's平衡液僅含有0.35g/L NaHCO3，不能用于5%CO2的環(huán)境，若放入CO2培養(yǎng)相，溶液將迅速變酸，使用時應(yīng)注意。

配制溶液應(yīng)使用雙蒸水或去離子水。如果配方中含有Ca2+、Mg2+，應(yīng)當(dāng)首先溶解這些成分。配好的平衡鹽溶液可以過濾除菌或高溫滅菌。

二、消化液：取材進(jìn)行原代培養(yǎng)時常常需要將組織塊消化解離形成細(xì)胞懸液，傳代培養(yǎng)時也需要將貼壁細(xì)胞從瓶壁上消化下來，常用的消化液有胰酶（Trypsin）溶液和EDTA溶液，有時也用膠原酶（collagenase）溶液。

1、胰酶溶液：胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示，常見有1：125和1：250，即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。組織培養(yǎng)用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%濃度，配制時要用不含Ca2+ 、Mg2+及血清的平衡鹽溶液（如前面的D-Hank's），因為這些物質(zhì)會對胰酶產(chǎn)生抑制作用。胰酶作用及溶解的pH是8-9，配制胰酶溶液應(yīng)將液體調(diào)至pH8左右，充分溶解，過濾除菌。過濾后可以再調(diào)只pH7.5，也可不調(diào)。

使用細(xì)胞清洗液配制胰酶消化液：含0.5%胰酶的細(xì)胞清洗液（100ml細(xì)胞清洗液加0.5g胰酶），過濾除菌，分裝于4度保存。

2、EDTA溶液：EDTA溶液也常用來解離細(xì)胞，它的作用機(jī)制是破壞細(xì)胞間的連接。對于一些貼壁特別牢固的細(xì)胞，還可以用EDTA和胰酶的混合液進(jìn)行消化。EDTA溶液的使用濃度為0.02%，配制時應(yīng)加堿助溶，配制后可過濾除菌，也可高溫消毒滅菌。

3、膠原酶溶液：膠原酶在上皮類細(xì)胞原代培養(yǎng)時經(jīng)常使用，膠原酶作用的對象是膠原組織，因此不容易對細(xì)胞產(chǎn)生損傷。膠原酶的使用濃度為0.1-0.3mg/L或200000U/L,作用的pH為6.5。膠原酶不受Ca2+ 、Mg2+及血清的抑制，配制時可用PBS。

三、pH調(diào)整液:常用的有HEPES液和NaHCO3溶液。

1、NaHCO3溶液：NaHCO3是培養(yǎng)基中必須添加的成分，一般情況下按說明書的要求準(zhǔn)確添加，以保證培養(yǎng)基在5%CO2的環(huán)境下pH達(dá)到設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)。如果是封閉式培養(yǎng)，即不與5%CO2的環(huán)境發(fā)生交換達(dá)到平衡，所使用的培養(yǎng)基就不能按照說明書所要求加入NaHCO3。此時常用5.6%或7.4%的NaHCO3溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基，使之達(dá)到所要求的pH環(huán)境。

2、HEPES溶液：是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細(xì)胞無毒性，主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2 氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時可以維持pH7.0左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時要添加HEPES。

四、抗生素:常用的是青鏈霉素，俗稱“雙抗溶液”。青霉素主要是對革蘭陽性菌有效，鏈霉素主要對革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預(yù)防絕大多數(shù)細(xì)菌污染。通常使用青霉素終濃度0.007-0.008g/100ml,鏈霉素終濃度0.01g/100ml。一般配制成100倍濃縮液，可用PBS或培養(yǎng)基配制。

五、谷氨酰胺補(bǔ)充液:谷氨酰胺在細(xì)胞代謝過程中起重要作用，合成培養(yǎng)基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解，4℃下放置7天即可分解約50%，所以都是在使用前添加。配制好的培養(yǎng)液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上時，要重新加入原來量的谷氨酰胺，故需單獨配制谷氨酰胺，以便臨時加入培養(yǎng)液內(nèi)。谷氨酰胺使用終濃度為0.002mol/L。一般配制為100倍濃縮液，即濃度為200mmol/L（29.22g/L），配制時應(yīng)加溫30℃，*溶解后過濾除菌，分裝至小瓶，儲存于－20℃。使用時，在每100ml培養(yǎng)液中加入0.5~2ml谷氨酰胺濃縮液，終濃度為1~4mmol/L。

六、二肽谷氨酰胺（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）

在細(xì)胞培養(yǎng)液中L-谷氨酰胺是大部分細(xì)胞培養(yǎng)基的基本成分；而L-谷氨酰胺是一種并不穩(wěn)定的氨基酸，在中性的水溶液中會自發(fā)降解；需要頻繁地補(bǔ)加L-谷氨酰胺。因而在培養(yǎng)操作過程中經(jīng)常：

（1）頻繁打開蓋子，增加了破壞無菌狀態(tài)的可能性；

（2）過多的追加L-谷氨酰胺，增加了培養(yǎng)基中氨的毒性水平。

二肽谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中穩(wěn)定而不降解,可高壓滅菌,釋放毒性氨較少!

二肽谷氨酰胺在細(xì)胞內(nèi)被氨肽酶（E.C.3.4.11.2）所水解，產(chǎn)生L-谷氨酰胺和L-丙氨酸；因此在大部分細(xì)胞系統(tǒng)中二肽谷氨酰胺就可以象L-谷氨酰胺同樣有效地被利用。二肽谷氨酰胺是替代物，它無需適應(yīng)；既可用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，也適合于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)。