1、適用范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了出口食品中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的檢驗(yàn)方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于出口食品的檢驗(yàn)。
2、設(shè)備和材料
2.1 吸管1.0mL和10.0mL，分別具有0.1mL和1.0mL刻度。
2.2 菌落計(jì)數(shù)器。
2.3 均質(zhì)器。
2.4 厭氧培養(yǎng)裝置。
2.5 超低溫冰箱。
2.6 恒溫培養(yǎng)箱：36±1℃。
2.7 恒溫水浴箱：46±1℃。
2.8 培養(yǎng)皿：90或100mm。
2.9 顯微鏡。
3、培養(yǎng)基和試劑
3.1 胰(月示)-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸(TSC)瓊脂。
3.2 D-環(huán)絲氨酸溶液。
3.3 卵黃乳液。
3.4 緩沖動(dòng)力-硝酸鹽培養(yǎng)基。
3.5 乳糖-明膠培養(yǎng)基。
3.6 產(chǎn)芽孢肉湯。
3.7 多價(jià)蛋白胨-酵母膏(PY)培養(yǎng)基。
3.8 硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基。
3.9 蛋白胨水。
3.10 亞硝酸鹽試劑。
3.11 緩沖甘油-氯化鈉溶液。
4、樣品制備
4.1 樣品的貯存和運(yùn)送如不能立即進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)在樣品中加等量緩沖甘油-氯化鈉溶液(液體食品應(yīng)加雙料的)。將樣品作低溫保存，直到檢驗(yàn)。運(yùn)送樣品時(shí)，應(yīng)使樣品保持冷凍狀態(tài)，并要避免容器破損。
4.2 制樣
將樣品解凍，取25g移入滅菌均質(zhì)杯，加225mL蛋白胨水，以13000r/min均質(zhì)2min，如為液體樣品，則取樣25mL，加入盛有225mL稀釋劑的500mL稀釋瓶中，搖勻，吸取此1:10樣品勻液10 mL加于90mL蛋白胨水中，搖勻，制成1:100樣品稀釋液，必要時(shí)，按此法將樣品作進(jìn)一步的10倍遞增稀釋，如從10**-3～10**-4……。
5、檢驗(yàn)
5.1 平板計(jì)數(shù)法
傾注不含卵黃的TSC瓊脂到10個(gè)滅菌平皿中，每皿約5mL，并迅速旋轉(zhuǎn)平皿，使瓊脂鋪平。當(dāng)瓊脂凝固后，將每個(gè)平皿編號(hào)標(biāo)記，以無菌操作，吸取稀釋液樣品1 mL分別加到每個(gè)瓊脂平板表面中心。再向平皿中傾注不含卵黃的TSC瓊脂15 mL，緩慢地旋轉(zhuǎn)平皿，使其與接種物混合均勻?！?br /> 也可用滅菌L 形玻璃棒，將0.1mL樣品稀釋液均勻地涂布于含卵黃乳液的TSC瓊脂上，將平行板水平靜置5～10min，使接種物被吸收。然后用不含卵黃的TSC瓊脂10 mL覆蓋平板表層(含卵黃的TSC瓊脂MAX適于同時(shí)含有其他還原亞硫酸鹽梭狀芽孢桿菌的食品)。瓊脂凝固后，將平板正置于厭氧罐內(nèi)，于36±1℃培養(yǎng)。不含卵黃的TSC瓊脂平板培養(yǎng)20 h，含卵黃的TSC瓊脂平板培養(yǎng)24h，取出平板，用肉眼觀察生長(zhǎng)情況和有無黑色菌落。挑選生長(zhǎng)有20～200個(gè)黑色菌落的平板，用菌落計(jì)數(shù)器將黑色菌落計(jì)數(shù)并計(jì)算每克食品中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌數(shù)。產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌落在含卵黃的培養(yǎng)基上呈黑色, 并通常有2～4mm寬的白色沉淀環(huán)(卵磷脂酶作用的結(jié)果)。但有少數(shù)菌株的卵磷脂酶反應(yīng)較弱，或呈陰性。應(yīng)對(duì)所有懷疑為產(chǎn)氣莢膜梭菌的黑色菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，并按5.2條加以證實(shí)。
5.2 證實(shí)
從可計(jì)數(shù)的平板(具20～200個(gè)菌落)中挑選10個(gè)典型菌落，分別接種到液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基試管中，36±1℃培養(yǎng)18～24h。取培養(yǎng)物涂片，作革蘭氏染色，鏡檢，檢查培養(yǎng)物的純度和細(xì)菌形態(tài)。產(chǎn)氣莢膜梭菌為革蘭氏陽性，粗短的梭狀芽孢桿菌。對(duì)于被污染的培養(yǎng)物可劃線接種在含有卵黃的TSC瓊脂平板上，于厭氧條件下36±1℃培養(yǎng)24 h，以獲得純培養(yǎng)物。
用3mm接種環(huán)，取液體硫乙醇酸鈉純培養(yǎng)物，或從TSC瓊脂平板上分離到的單個(gè)菌落，穿刺接種緩沖動(dòng)力-硝酸鹽和乳糖-明膠培養(yǎng)基。以1 mL液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)物接種到產(chǎn)芽孢肉湯中，36±1℃培養(yǎng)24 h。在透射光下檢查緩沖動(dòng)力-硝酸鹽培養(yǎng)基試管中細(xì)菌沿穿刺線生長(zhǎng)情況,有動(dòng)力的菌株沿著穿刺線呈擴(kuò)散生長(zhǎng)。沒有動(dòng)力的菌株,僅沿著穿刺線生長(zhǎng)?！ 〖?.5mL試劑甲和0.2 mL試劑乙于緩沖動(dòng)力-硝酸鹽培養(yǎng)基中以檢查亞硝酸鹽的存在。于15min內(nèi)出現(xiàn)橙色者，表明有亞硝酸鹽存在。如果不出現(xiàn)顏色變化，則加少許金屬鋅粉,放置10 min。如果加鋅粉后，不出現(xiàn)顏色變化，表明硝酸鹽已*還原成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽又被分解成了氨和氮，如變?yōu)槌壬?，表明菌株不能還原硝酸鹽?！?/p>
檢查乳糖-明膠培養(yǎng)基,如發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣和培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色, 表明乳糖發(fā)酵并產(chǎn)酸。將試管置5℃冷卻1h，檢查明膠液化情況。如果培養(yǎng)基是固態(tài)，需36±1℃再培養(yǎng)24 h，重復(fù)檢查明膠是 否液化。用產(chǎn)芽孢肉湯涂片作革蘭氏染色，在顯微鏡下檢查有無芽孢。如需對(duì)分離物作進(jìn)一步檢查，應(yīng)將芽孢培養(yǎng)物于4℃存放。
無動(dòng)力、革蘭氏陽性，在TSC瓊脂平板上產(chǎn)生黑色菌落，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣，在48 h內(nèi)液化明膠的桿菌，可初步認(rèn)為是產(chǎn)氣莢膜梭菌。可疑為產(chǎn)氣莢膜梭菌而又不符合上述特征的，必須做進(jìn)一步證實(shí)試驗(yàn)。對(duì)不液化明膠或在其他方面不典型的分離物要接種液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基，36±1℃培養(yǎng)24h，進(jìn)行涂片，作革蘭氏染色，檢查培養(yǎng)物的純度，以0.1 mL液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)物，接種到含1％水楊甙和含1％棉子糖的PY培養(yǎng)基各1 管，觀察產(chǎn)酸和產(chǎn)氣，取1.0 mL培養(yǎng)物放于試管中，加1～2滴0.04％酚紅溶液，檢查是否產(chǎn)酸(大多數(shù)產(chǎn)氣莢膜梭菌，不發(fā)酵水楊甙，但同它密切相關(guān)的梭狀芽孢菌，能迅速發(fā)酵水楊甙產(chǎn)酸產(chǎn)氣)。再將此兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，觀察產(chǎn)酸情況。產(chǎn)氣莢膜梭菌通常在含棉子糖的培養(yǎng)基中產(chǎn)酸，而同其密切相關(guān)的其他梭狀芽孢菌卻不能在含棉子糖的培養(yǎng)基中產(chǎn)酸。有少數(shù)產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株，在含水楊甙的PY培養(yǎng)基中產(chǎn)酸。
6 結(jié)果解釋及報(bào)告
樣品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的計(jì)數(shù), 基于被證實(shí)為產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落的百分?jǐn)?shù)(例如,10(-4)稀釋的平板中，平均有85個(gè)菌落，10個(gè)菌落中，有8 個(gè)被證實(shí)為產(chǎn)氣莢膜梭菌，那么每克食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)，即為85×(8/10)×10000＝680000)，報(bào)告產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌數(shù)/g(mL)?！?/p>
A 培養(yǎng)基和試劑的配制(補(bǔ)充件)
A1 胰(月示)-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸(TSC)瓊脂
胰(月示) 15.0g
大豆胨 5.0g
酵母膏 5.0g
偏亞硫酸氫鈉[sodium bisulfite(meta)] 1.0g
檸檬酸鐵銨 1.0g
瓊脂 20.0g
加蒸餾水稀釋到1000mL，調(diào)至pH7.6±0.1，分裝到500mL燒瓶中，每瓶250mL。121℃高壓滅菌15min，倒平皿前，每250mL培養(yǎng)基(50℃)中，加過濾除菌的0.5％ D-環(huán)絲氨酸溶液20.0mL?！?br /> 制作卵黃平板：加50％卵黃乳液20 mL到250 mL含D-環(huán)絲氨酸培養(yǎng)基中，傾注到無菌平皿中，每皿約15mL。使用前應(yīng)將平皿置室溫使其干燥。
A2 D-環(huán)絲氨酸溶液
溶解1gD-環(huán)絲氨酸于200 mL磷酸鹽緩沖液(c＝0.05mol/L)(pH8.0±0.1)中(不加熱)，經(jīng)0.45μm濾膜過濾除菌。
A3 卵黃乳液
用硬刷刷洗鮮蛋，瀝干，放70％乙醇中浸泡1h。以無菌操作取出蛋黃，加等體積無菌0.8％氯化鈉溶液，混合置超低溫保存箱4℃貯存。
A4 緩沖動(dòng)力-硝酸鹽培養(yǎng)基
C8H9Cl 3.0g
蛋白胨 5.0g
硝酸鉀 5.0g
磷酸氫二鈉(Na2HPO4) 2.5g
半乳糖 5.0g
甘油 5.0g
瓊脂 3.0g
用蒸餾水溶解并稀釋到1000mL。調(diào)至pH7.3±0.1，分裝試管，每管11mL。121℃高壓滅菌15min。
A5 乳糖-明膠培養(yǎng)基
胰(月示) 15.0g
酵母膏 10.0g
乳糖 10.0g
磷酸氫二鈉(Na2HPO4) 5.0g
酚紅 0.05g
明膠 120.0g
用蒸餾水溶解并稀釋到1000mL，調(diào)至pH7.5±0.1，加入乳糖和酚紅。分裝試管，每管10 mL。121℃高壓滅菌15min。
A6 產(chǎn)芽孢肉湯
多價(jià)胨(polypeptone) 15.0g
酵母膏 3.0g
可溶性淀粉 3.0g
硫酸鎂 0.1g
硫乙醇酸鈉 1.0g
磷酸氫二鈉(Na2HPO4) 11.0g
用蒸餾水溶解稀釋到1000mL，調(diào)至pH7.8±0.1，分裝試管，每管15 mL。121℃高壓滅菌15min。
A7 多價(jià)蛋白胨-酵母膏(PY)培養(yǎng)基
多價(jià)胨 20.0g
酵母膏 5.0g
氯化鈉 5.0g
用蒸餾水溶解并稀釋到1000mL, 調(diào)至pH6.9±0.1, 分裝到帶螺帽的試管內(nèi),每管9mL。121℃高壓滅菌15 min。
A8 硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基
胰酪胨 15.0g
L-胱氨酸 0.5g
氯化鈉 2.5g
葡萄糖 5.0g
酵母膏 5.0g
硫乙醇酸鈉(或硫乙醇酸) 0.5g
刃天青鈉溶液(1:1000)(新鮮配制) 1 mL
瓊脂 0.75g
將胱氨酸、氯化鈉、葡萄糖、酵母膏和胰胨同1000mL蒸餾水混合，并在阿諾氏消毒器或蒸氣浴中加熱，直至*溶解，并加入硫乙醇酸鈉或硫乙醇酸溶液，使溶解。如必要可用1mol/L氫氧化鈉調(diào)整pH，使消毒后的pH在7.1±0.2，加刃天青鈉溶液，混合，將培養(yǎng)基分裝到150mm×16mm螺旋蓋試管內(nèi)，每管10mL，121℃高壓滅菌20min。
A9 蛋白胨水
在2000 mL蒸餾水中溶解蛋白胨2.0g，調(diào)至pH7.0±0.1。在200 mL瓶中分裝90 mL，在500 mL錐形瓶中分裝225 mL。121℃高壓滅菌15min。
A10 亞硝酸鹽試劑
a．試劑甲 在1000mL 5mol/L乙酸中溶解對(duì)氨基苯磺酸8g；
b. 試劑乙 在1000mL 5mol/L乙酸中溶解α-萘酚5g。
A11 緩沖甘油-氯化鈉溶液
在900mL蒸餾水中溶解氯化鈉4.2g，加無水磷酸氫二鉀12.4g，無水磷酸二氫鉀4.0g和甘油100mL，混合，充分溶解。調(diào)至pH7.2。121℃高壓滅菌15min?！?br /> 配制雙料緩沖甘油溶液(20％)時(shí)，用甘油200mL和蒸餾水800mL。
