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原代細(xì)胞培養(yǎng)方法

更新時(shí)間:2018-08-10  |  點(diǎn)擊率:2105

 

        原代細(xì)胞培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng),是建立細(xì)胞系的步,其步驟包括取材→分離→培養(yǎng)和維持,今天喆圖小編給大家?guī)碓?xì)胞培養(yǎng)的一些技巧,希望大家能有所收獲!

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原代細(xì)胞培養(yǎng)


原代細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用


1、為研究生物體細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝、繁殖提供有力的手段;

2、為傳代培養(yǎng)創(chuàng)造條件;

3、服務(wù)于臨床實(shí)踐,用于藥物篩選等。


原代細(xì)胞培養(yǎng)之取材


取材作為原代細(xì)胞培養(yǎng)過程中的部至關(guān)重要,以下幾種取材技術(shù),你都用過哪些方法呢?

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兔髓核



原代細(xì)胞培養(yǎng)之分離注意事項(xiàng)


1、組織塊培養(yǎng)法

1)組織塊接種后的前3天,在觀察和移動(dòng)的過程中,注意不要引起液體的振蕩。要避免經(jīng)常翻動(dòng)和振動(dòng),否則組織塊不易附著于瓶壁上或附著后也會(huì)脫落飄起。


2)加入的培養(yǎng)液不宜過多,避免浸泡的組織塊受輕微的波動(dòng)而脫落下來。


3)當(dāng)細(xì)胞向外遷徙出來后要注意記錄并去除漂浮的組織塊和殘留的細(xì)胞,它們產(chǎn)生的有毒物質(zhì)會(huì)影響原代細(xì)胞的生長(zhǎng)。


4)為促進(jìn)組織塊盡快粘貼在培養(yǎng)瓶皿上,可以在種植前先將膠原薄層涂在培養(yǎng)瓶底壁上。


2、貼壁型原代細(xì)胞

1)原代培養(yǎng)的分離細(xì)胞在初次接觸體外環(huán)境時(shí),它們之間會(huì)互相影響,在這些細(xì)胞之間能產(chǎn)生一些促生長(zhǎng)的活性物質(zhì),使細(xì)胞彼此互相促進(jìn)存活和生長(zhǎng)。如果接種的細(xì)胞密度過低,細(xì)胞之間的促生長(zhǎng)作用很小,也很難使細(xì)胞適應(yīng)從體內(nèi)的組織環(huán)境到被分散后進(jìn)入獨(dú)立生存環(huán)境的變化過程。如果接種的細(xì)胞密度過大,會(huì)導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足,代謝廢物積累較快需要經(jīng)常換液和傳代。


2)適當(dāng)增大原代培養(yǎng)接種的細(xì)胞密度,給培養(yǎng)的細(xì)胞提供更多的類似于在體內(nèi)時(shí)細(xì)胞之間的相互作用,會(huì)極大提高原代培養(yǎng)的細(xì)胞在體外存活率。待細(xì)胞適應(yīng)體外環(huán)境后進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)再以較低的密度接種和培養(yǎng)。


3)盡快使接種的細(xì)胞貼壁,是決定培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵??梢栽诮臃N后先將培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3h到5h,待細(xì)胞貼壁后,再補(bǔ)足培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。


3、懸浮型原代細(xì)胞

1)必須保持細(xì)胞的懸浮狀態(tài)??梢酝ㄟ^增加培養(yǎng)液的黏度來幫助細(xì)胞呈懸浮狀態(tài),如給培養(yǎng)液中加入低濃度的透明質(zhì)酸復(fù)合物。在有攪拌裝置的培養(yǎng)器皿內(nèi)加入培養(yǎng)液是,以5ml為低限度,否則攪拌時(shí)會(huì)產(chǎn)生氣泡對(duì)細(xì)胞造成傷害。使用這種方式需注意勿使攪拌速度過快,否則即可使培養(yǎng)液溢出又容易造成污染。如果培養(yǎng)液的量在5ml以下,可以采用旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。給懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞換液時(shí)要注意不要吸出細(xì)胞。


2)能夠進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞,其生命力一般都比較旺盛,體外分裂增殖的速度較快,營(yíng)養(yǎng)成分消耗大,換液時(shí)間隔一般較短。


原代細(xì)胞培養(yǎng)問題解答


1、原代細(xì)胞與細(xì)胞系有什么區(qū)別?

根據(jù)傳統(tǒng)定義,自組織次收獲和接種的細(xì)胞被稱為原代細(xì)胞 [Freshney, R.I. (1987). Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique. (New York, Alan R. Liss, Inc.)]. 這類細(xì)胞直接從組織分離,生命周期有限,經(jīng)數(shù)次傳代后會(huì)逐漸停止生長(zhǎng)。原代細(xì)胞在有限的生命周期內(nèi)需掌握好細(xì)胞的大生長(zhǎng)空間,以保持細(xì)胞群中基因型和表型的一致性。


細(xì)胞系是不斷生長(zhǎng)、分化的細(xì)胞群,因其經(jīng)過遺傳改造,致使其具有無限增長(zhǎng)的潛能。體外生長(zhǎng)的細(xì)胞系用于醫(yī)療或科研。


但實(shí)際上,經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間、連續(xù)的傳代培養(yǎng)后,細(xì)胞系隨著代數(shù)的增加,細(xì)胞的基因型和表型都有可能發(fā)生改變。


需要指出的是,在不同的科研小組中這些術(shù)語的定義會(huì)有所不同。許多研究員不用細(xì)胞系這個(gè)詞表示細(xì)胞群,除非細(xì)胞經(jīng)過了遺傳改造。


2、倍增和代數(shù)有什么區(qū)別?

倍增是培養(yǎng)物中細(xì)胞總數(shù)的翻倍,通常是指細(xì)胞指數(shù)或?qū)?shù)生長(zhǎng)期。代數(shù)是指細(xì)胞群從培養(yǎng)瓶中移出,傳代培養(yǎng)過程的次數(shù),傳代培養(yǎng)的目的,是使細(xì)胞處于低密度以刺激其進(jìn)一步生長(zhǎng)。


3、接收到的凍存細(xì)胞該如何處理?

收到包裝箱后,立即將凍存細(xì)胞從干冰移入液氮中凍存。此過程盡量快,以避免升溫。不要將細(xì)胞儲(chǔ)存在-80℃,這樣會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不可挽回的傷害。


4、凍存的細(xì)胞該如何開始培養(yǎng)?

(1) 將一管細(xì)胞從液氮罐中取出,注意保護(hù)手和眼睛。

(2) 將凍存管快速的放入37℃水浴中,輕輕握住并旋轉(zhuǎn),直到管內(nèi)物體*融化。

(3) 將凍存管立即從水浴中拿出,擦干,轉(zhuǎn)入無菌環(huán)境。

(4) 用70%的酒精沖洗凍存管,然后擦去多余酒精。

(5) 打開蓋子,注意手指不要碰到里面的螺紋(注意,由于凍存管有負(fù)壓,開蓋時(shí)可能會(huì)有少量溢出,這是正常現(xiàn)象)。

(6) 用多聚賴氨酸(或參照說明書)包被培養(yǎng)瓶。多數(shù)細(xì)胞推薦的接種密度為每平方厘米5000個(gè)細(xì)胞。

(7) 蓋好培養(yǎng)瓶的蓋子,輕輕搖晃培養(yǎng)瓶以使細(xì)胞分布均勻。若需要?dú)怏w交換可打開蓋子。

(8) 將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中(37℃,5%CO2,95%空氣)CO2培養(yǎng)箱

(9) 放入培養(yǎng)箱后第6-16小時(shí)更換一次培養(yǎng)基,以去除殘留的二甲基亞楓和未貼壁的細(xì)胞。


5、細(xì)胞培養(yǎng)過程中,多久更換一次培養(yǎng)基?

這取決于細(xì)胞生長(zhǎng)的速度。一般而言2-3天更換一次培養(yǎng)基,許多細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室通常在周一,周三,周五更換培養(yǎng)基。

注意:凍存細(xì)胞復(fù)蘇后,在6-16小時(shí)內(nèi)更換培養(yǎng)基,以去除殘留的二甲基亞楓和死亡的細(xì)胞。


6、我能擴(kuò)增培養(yǎng)和再次凍存原代正常人類細(xì)胞嗎?

這取決于細(xì)胞的類型。一些細(xì)胞類型像神經(jīng)細(xì)胞,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和一些生長(zhǎng)緩慢的上皮細(xì)胞,不推薦擴(kuò)增培養(yǎng)和再次凍存。其它的細(xì)胞類型像成纖維細(xì)胞、星形細(xì)胞、腎系膜細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等等,可以擴(kuò)增培養(yǎng)和再次凍存。

然而,需要注意的是再次凍存的過程可能導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)性能的改變。


以上就是喆圖小編簡(jiǎn)單介紹的培養(yǎng)方法,希望能給大家?guī)韼椭?/p>

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